植物组织培养的基本技术（上）

一、植物组织培养的一般程序：

植物组织培养除需要具备最基本的实验设备条件外，还必须熟练掌握植物组织培养的基本操作技术，这是培养成功的前提条件。

1、准备阶段

查阅相关文献，根据己成功培养的植物或亲缘关系密切植物的研究结果，结合实际制定出切实可行的试验方案。然后根据试验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。

2、外植体选择与消毒

选择合适的部位作为外植体，样品经过适当的预处理，然后进行消毒处理。将消毒后的样品在无菌条件下切割成外植体—一定大小的小块，或剥离出茎尖、挑出花药等，接种到初代培养基上。

3、初代培养

接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使外植体中己分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。然后将愈伤组织转移到分化培养基，分化成不同的器官原基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。

4、继代培养

分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的继代培养基经反复多次切割转接。当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养需要提前进行病毒检测。

5、生根培养

刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降低细胞分裂素浓度或不加外源细胞分裂素，提高生长素派度，促进小苗生根，提高其健壮度。

6、炼苗移栽

选择生长健壮的生根苗进行室外炼苗，待苗适应外部环境后，再移栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮阳，防止病虫危害。经环境适应性驯化后的组培苗即可移栽大田用于生产。

二、植物培养基的成分

1、水分

水分是培养基的主要组成成分，在植物组织培养中，水分既是培养物生命活动必需的成分，也是各种营养物质溶解和代谢的介质。配制培养基母液时要用蒸馏水或纯水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程中发霉变质。研究培养基配方时尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起结论的偏差。但在生产中，为了节约成本，常用自来水代替蒸馏水，但要注意自来水的硬度和酸碱度，如自来水中含有大量的钙、镁、氯和其他离子，最好将自来水煮沸，经过冷却沉淀后再使用。

2、无机化合物

除了碳、氧、氢外，已知还有12种元素对植物的生长是必需的。根据植物生长需求量分为大量元素和微量元素两类。

（1）大量元素（macroelement）

包括氮（N)、磷（P)、钙（Ca）、钾（K）、镁(Mg)、硫（S)、氯（CI）。氮主要以硝态氮（NO3-，）和铵态氮（NH4+）两种形式被使用，常使用的含氮化合物有硝酸钾(KNO3）、硝酸铵（NH4NO3。）或硝酸钙〔Ca(NO3)2〕。大多数培养基将硝态氮和铵态氮两者混合使用，以调节培养基的离子平衡，利于细胞生长发育。当作为唯一的氮源时，硝酸盐的作用好于铵盐，但时间长了会对培养物产生毒害作用，若在硝酸盐中加入少量的铵盐，会阻止这种危害的发生。磷常用磷酸盐来提供，常用的有磷酸二氢钾(KH2PO4）或磷酸二氢钠（NaH2PO4)。钾对碳水化合物合成、转移以及氮素代谢等有密切关系，在培养基中含量要求较高，常用的含钾化合物有氯化钾（KCl）或硝酸钾(KNO3)。钙、镁、硫也是培养基必需的大量元素，浓度以1~3mmol/L为宜，常以MgSO4和钙盐的形式供给。

（2）微量元素（microelement）

包括铁、硼、锰、锌、铜、钴、钼等。虽然植物生长对微量元素需要量很少，但也是必需的，一般用量为10-7~10-5mol/L，稍多即会发生毒害。微量元素是许多酶和辅酶的重要组成成分，生理作用主要体现在酶的催化功能和细胞分化、维持细胞的完整机能等方面。微量元素中，铁盐是用量较多的一种微量元素，铁对叶绿素的合成和延长生长起重要作用，铁元素不易被植物直接吸收和利用，通常以硫酸亚铁(FeSO4）和乙二胺四乙酸二钠盐（Na2-EDTA）的形式添加，以避免Fe2+氧化产生氢氧化铁沉淀发生。

3、有机化合物

对于植物组织培养中幼小的培养物而言，由于其光合作用的能力较弱，为了维持培养物正常的生长、发育与分化，培养基中除了提供无机营养成分以外，还必须添加糖类、维生素、氨基酸等有机化合物。

（1）糖类(sugar）

植物组织培养中幼小的培养物不同于完整的植株，由于其自养能力较弱，培养基中的糖类物质就成了其生命活动中必不可少的碳源和能源。除此之外，糖类的添加还有调节培养基渗透压的作用。常用的糖类有蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖等，其中蔗糖使用最为普遍，浓度一般为2%~5%。蔗糖在高温高压灭菌时，会有一少部分分解成葡萄糖和果糖。不同糖类对培养物生长的影响不同，一般来说，以蔗糖为碳源时，离体培养的双子叶植物的根生长的更好，而以葡萄糖为碳源时，单子叶植物的根生长的更好。在大规模生产中，蔗糖价格太贵，常用食用绵白糖、白砂糖代替蔗糖，但在不同的植物种类上，其使用的可行性及其浓度范围需要做小规模的生产性实验。

（2）维生素(vitamin）

维生素直接参加生物催化剂即酶的形成，以及蛋白质、脂肪的代谢等重要生命活动。由于大多数植物细胞在培养过程中不能合成足够的维生素，所以在培养基中必须补充一种或几种维生素，有利于植物细胞的生长发育。常用的维生素浓度为0.1~1.0mg/L，主要有盐酸硫胺素（维生素B1），烟酸（维生素B5）、盐酸吡哆醇（维生素B6）、抗坏血酸（维生素C），有的培养基还需添加生物素（维生素H)、叶酸（维生素M）、核黄素（维生素B2）等。其中维生素B1可全面促进植物的生长，维生素C可防止褐变，维生素B6能促进根的生长。

（3）肌醇(inositol）

又名环己六醇，通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成，对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，在糖类的相互转化中起重要作用。一般使用浓度为50~100mg/L。

（4）氨基酸及有机添加物(aminoacidandorganicaddition）

氨基酸作为一种重要的有机氮化合物，可直接被细胞吸收利用。它除了是蛋白质的组成成分外，还具有缓冲作用和调节培养物体内平衡的功能，对外植体的芽、根、胚状体的生长分化有良好的促进作用。组织培养中常用的氨基酸有甘氨酸，其它有精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及多种氨基酸的混合物，如水解乳蛋白（LH）、水解酪蛋白（CH)等。氨基酸类物质不仅为培养物提供有机氮源，同时也对外植体的生长以及不定芽、不定胚的分化起促进作用。在有些培养基中还加入一些天然的化合物，如椰乳(CM)(100~200g/L）、酵母浸出物（0.5%)、番茄汁（5%~10%）、马铃薯泥(100~200g/L）等，其有效成分为氨基酸、酶、蛋白质等，这些天然化合物对细胞和组织的增殖和分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显，由于其成分复杂且不确定，因而在培养基配制中尽量使用已知成分的合成有机物。

4、植物生长调节物质

植物生长调节剂（plant growth regulator）是培养基中的关键性物质，用量虽然微小，但其作用很大，根据组织培养的目的、外植体的种类、器官的不同和生长表现来确定植物生长调节剂的种类、浓度和比例关系，可以调节植物组织的生长发育进程、分化方向和器官发生，植物生长调节物质对植物组织培养起着决定性作用，也是培养基的 “秘诀”。植物生长调节剂包括生长素类、细胞分裂素类及赤霉素、脱落酸、多效唑等多种，它们在植物组织培养中具有不同的作用。

（1）生长素类(auxin）

在植物组织培养中，生长素的主要作用有促进细胞分裂和伸长，诱导愈伤组织的产生，促进茎尖生根，还会诱导某些植物不定胚的形成。常用的生长素有吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、2,4-二氯苯乙酸（2,4-D）等。生长素与细胞分裂素配合使用，共同促进不定芽的分化、侧芽的萌发与生长。但是2,4-D往往会抑制芽的形成，适宜的用量范围较窄，过量又有毒害，一般用于细胞启动脱分化阶段；而诱导分化和增殖阶段一般选用IAA、NAA、IBA。它们作用的强弱依次为2,4-D>NAA>IBA>IAA，常用的浓度为0.1~10mg/L。生长素一般溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH(KOH)溶液中，后者溶解效果较好。

（2）细胞分裂素类(cytokinin）

细胞分裂素的主要作用有促进细胞分裂和扩大，诱导胚状体和不定芽的形成，延缓组织衰老促进蛋白质合成。在植物组织培养时，细胞分裂素：生长素的比值控制器官发育模式，若增加生长素浓度，有利于根的形成；增加细胞分裂素浓度则促进芽的分化。

（3）赤霉素（gibberellins，GA）

天然的赤霉素有100多种，在培养基中添加的主要是GA3。其作用有促进细胞生长和打破休眠。一般情况下，赤霉素对组织培养中器官和胚状体的形成有抑制作用，在器官形成后，可促进器官或胚状体的生长。赤霉素虽易溶于水但溶于水后不稳定，容易分解。因此，最好用95%酒精配制成母液在冰箱中保存。

（4）脱落酸（abscissicacid，ABA）

脱落酸有抑制生长、促进休眠的作用，在植物组织培养中，适量的外源ABA可明显提高体细胞胚的数量和质量，抑制异常体细胞胚的发生。在植物种质资源超低温冷冻保存时，可以用ABA促使植物停止生长和抗寒力的形成，从而保证冷冻保存的顺利进行。

（5）其他类

除上述生长调节物质外，在植物组织培养中应用的还有多胺（polyamines，PA），多效唑（PP333）、油菜素內脂(brassinolide，BR)、茉莉酸及其甲脂（jasmonicacid，JA）、水杨酸（salicylicacis，Sa）等，由于多胺对植物的生长发育、形态建成及抗逆性有重要调节作用，常可用于调控部分植物外植体的不定根、不定芽、花芽、体细胞胚的发生发育以及延缓衰老、促进原生质体分裂及细胞形成等。多效唑具有控制生长、促进分蘖和生根等生理效应，可促使试管苗的壮苗、生根，提高抗逆性及移栽成活率。茉莉酸及其甲脂、水杨酸对诱导试管鳞茎、球茎、块茎及根茎等变态器官的形成有促进作用。

5、培养基中其它成分

由于培养目的和培养材料不同，往往还加入一些其它成分，如培养基的凝固剂、活性炭、抗生素、抗氧化物质、诱变剂等。

（1）凝固剂(coagulant）

在培养基的组成中，除上述营养成分外，为使培养材料在培养基上固定和生长，需要加入凝固剂，形成固体培养基（solidmedia），如果未加入凝固剂，称为液体培养基（liquidmedia）。

琼脂（agar）是常用的凝固剂，它是一种由海藻得来的多糖类物质，本身不提供任何营养成分，仅溶于95℃的热水中，温度降到40℃以下时凝固。一般使用浓度是3~10g/L。若浓度过高，培养基就会变硬，使培养材料不容易吸收到培养基中的营养物质。浓度过低，则培养基硬度不够，培养材料在培养基中不易固定，易发生玻璃化现象。

固体培养基优点是所需设备简单，使用方便，只需一般化学实验室的玻璃器皿和可调控温度及光照的培养室。但也存在缺点，将培养物固定在一个位置，培养物与培养基接触面积小，各种养分在培养基中扩散慢从而影响到养分的吸收利用，同时培养物的生长过程合成的有害物质积累，会造成自我毒害，必须及时转接。对于某些试验体系来说，液休培养基的效果可能比固体培养基更好，培养时需要转床、摇床等设备，通过振荡培养，给培养物提供良好的通气条件，有利于外植体的生长，避免了固定培养基的缺点。

（2）活性炭（activecarbon)

培养基中添加活性炭的主要作用是利用其吸附能力，吸附由培养物分泌的抑制物质及琼脂中所含的杂质，减少一些有害物质的影响，防止酚类物质引起组织褐变死亡，活性炭还可促进某些植物生根；活性炭还可降低玻璃化苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用。但活性炭对物质吸附无选择性，既吸附有害物质，也吸附必需的营养物质，因此使用时应慎重考虑，不能过量，一般用量为0.5%~3%。

（3）抗生素(Canohioico）

培养基中添加抗生素可防止菌类污染，减少培养材料损失。使用抗生素时应注意以下四个问题：

①不同抗生素能有效抑制的菌种具有差异性，因此必须有针对性地选择抗生素种类；

②在某些情况下，无论单独使用哪一种抗生素对污染皆无效，必须几种抗生素配合使用才能取得较好的效果；

③当所用抗生素的浓度高到足以消除内生菌时，有些植物的生长发育往往也同时受到抑制；

④在停用抗生素后，污染率往往显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成的。

常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素等，用量一般为5~20mg/L，且大部分抗生素需要过滤除菌。

（4）硝酸银

离体培养中植物组织会产生和散发乙烯，而乙烯在培养容器中的积累会影响培养物的生长和分化，严重时甚至导致培养物的衰老和落叶。硝酸银通过竞争性结合细胞膜上的乙烯受体蛋白，从而可起到抑制乙烯活性的作用。因此，在许多植物组织培养时，在培养基中加人适量硝酸银，能起到促进愈伤组织器官发生或体细胞胚胎发生的作用，并使某些原来再生困难的物种分化出再生植株。此外，硝酸银对克服试管苗玻璃化、早衰和落叶也有明显效果。但也有研究指出，硝酸银并非总能抑制乙烯的积累。由于低浓度的硝酸银能引起细胞坏死，从而产生的乙烯大于同一组织内非坏死细胞所产生的数量，因此，不要把培养物长期保存在含硝酸银的培养基上，否则，会导致再生植株畸形。硝酸银的使用浓度一般为1~10mg/L。

6、培养基pH值

培养基的pH在高压灭菌前一般调至5.0~6.0，最常用的pH值为5.8~6.0。当pH高于6.0时，培养基会变硬。低于5.0时，琼脂凝固效果不好。高压灭菌后，培养基的pH值稍有下降。因此，分装前必需进行pH的调整，一般用1mol/L的HCI或NaOH进行pH调整。