植物基因组DNA提取及其检测

一、背景知识

在分析和研究DNA时，提取和纯化DNA是第一步操作，也是实验的基础。对于植物来说，DNA主要存在于细胞核内，核内DNA占整个细胞DNA量的90%以上；核外的DNA主要有线粒体DNA和叶绿体DNA。所有植物基因组DNA的获得都包括两个步骤：一是裂解细胞和溶解DNA；二是通过一种或多种酶学或化学的方法除去蛋白质、RNA和其他大分子杂质。

不同植物、同种生物的不同种类、同一种类的不同组织器官因其细胞结构和所含成分不同，基因组DNA提取方法既有共同的操作方法，也有特殊的处理步骤。在提取某些特殊组织器官DNA时，需要参考前人经验采用相应的改良提取方法，从而获得高质量的可用DNA大分子。如从富含多酚和多糖的组织中提取DNA，应增加除去多酚和多糖的实验步骤，以免残留物抑制后续的酶切、PCR等操作。

不同的实验目的对提取的DNA质量要求也不相同。构建基因组文库、基因分型、RFLP（限制性片段长度多态性）和Southern杂交等实验对初始DNA长度要求较大，而普通PCR反应则要求较低。植物基因组DNA在提取过程中会发生机械断裂，产生不同大小的片段，因此，应该尽量减少酚/氯仿抽提次数、混匀过程要轻缓，以保证得到较为完整的基因组DNA。

目前，CTAB法是植物基因组DNA提取的常用方法之一，是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的简便方法。后续一些研究者对该法进行了改进和发展。

二、实验原理

CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当溶液盐浓度降低到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB–核酸的复合物与蛋白、多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

在CTAB提取缓冲液中，Tris–HCl （pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg²⁺或Mn²⁺，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使CTAB–核酸复合物充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β–巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

三、实验目的

1. 掌握核酸提取的原理和方法。

2. 认识核酸的基本性质以及操作核酸的基本步骤。

3. 掌握水平凝胶电泳的原理及注意事项。

4. 后续实验准备样品。

四、实验材料

小麦、玉米和水稻等植物的幼嫩叶片。可提前4～7 d在培养皿或育苗盘中播种、育苗，实验前剪取新鲜叶片。

五、试剂与仪器

液氮、CTAB提取缓冲液、氯仿/异戊醇（24∶1）、异丙醇、70%乙醇、TE 缓冲液、灭菌ddH₂O、琼脂糖、6 ×上样缓冲液、50 × TAE电泳缓冲液、溴化乙啶EB。

研钵、剪刀、微量移液器、灭菌1.5 mL离心管、灭菌枪头、锥形瓶、量筒。

台式离心机、水浴锅、电子天平、微波炉、电泳槽、电泳仪、紫外成像仪。

六、实验步骤及其解析

（一）植物基因组DNA提取

1．将1 g左右新鲜叶片剪成1～2 cm片段，搁置于研钵中，加入约50 mL的液氮，轻轻捣碎叶片，待液氮将要挥发完时，迅速研磨成白绿色粉末，置入1.5 mL 离心管中。

不同植物、不同组织、不同年龄的材料提取DNA产率不同，植物幼嫩组织产率高。

尽量采用新鲜材料。若是–80℃冰箱保存的样品，研磨前应避免样品化冻变软。

100 mg新鲜植物幼嫩组织可获得5～15 μg DNA。适量分装样品粉末到离心管。

研磨得越细越好，以便很好地解离细胞、破碎细胞壁，并提高DNA产率。

液氮尽量一次加足。若需第二次加液氮，不要让飞浮起的粉末污染了液氮勺。

快速分装。加CTAB提取缓冲液前，粉末不能化冻变成绿色泥状物。将粉末从研钵转移到离心管前，可将勺和离心管在液氮预先冷冻一下。

2．马上加入600 μL预热的CTAB提取缓冲液（至少预热30 min），混匀，65℃水浴提取1 h，其中每10 min颠倒混匀1次。

样品重量增加，应相应地增加提取缓冲液的用量。对于较老的植物组织，可以适当加大提取液中β-巯基乙醇的用量，如2.5%～3.0%，从而减轻褐变。

预热可使CTAB均匀分布，并使样品粉末快速溶于提取液。

水浴振荡提取可以促进细胞裂解。不要让离心管盖崩开。

剧烈振荡会打断溶液中分子质量高的DNA。

如需得到无RNA的DNA，也可以在水浴后加入20 μL 10 mg/mL RNase A，室温放置2～5 min。

3．取出离心管，冰浴冷却5 min 后，加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1）抽提液，轻轻颠倒混匀，冰上静置10 min。

冰浴冷却是为了下一步加入抽提液时降低氯仿的挥发。应在通风橱内加入抽提液。

有的实验使用苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）。苯酚能有效地变性蛋白质，并能溶解变性蛋白质；氯仿也是蛋白质变性剂，但加入氯仿的主要原因是增加抽提液比重，使得酚/氯仿始终在下层的有机相，方便水相的回收；异戊醇可防止混合时产生泡沫，更好地形成水相和有机相之间的界面。

充分混合后静置有利于水相和有机相的分层。上层水溶液（水相）含有DNA，下层（有机相）主要是氯仿，大多数的变性蛋白质处于两相之间的界面上。

混匀过程要轻柔舒缓，以免DNA发生机械断裂。

4．室温6 000 r/min离心10 min，用剪掉尖头的枪头小心吸出上清液500 μL（淡黄色或无色），放入新离心管中。

剪掉枪头尖可以减缓吸取时的抽力，避免DNA断裂和吸入有机相物质。

吸取动作要细心缓慢，不要吸得过多过快（可分几次吸取），避免振荡，以免吸取了水相和有机相中间的杂质，影响抽提纯化效果。

整个实验操作过程中，应戴手套和使用灭菌的离心管和枪头，避免核酸酶污染。

5．加入等体积的异丙醇，上、下颠倒混匀数次，即出现絮状DNA沉淀。室温下8 000 r/min离心10 min。

用乙醇可使DNA溶液中的DNA沉淀，是因为乙醇可以使DNA脱水。

乙醇分子含1个羟基，异丙醇2个羟基，因离心管体积所限，故用等体积异丙醇，但异丙醇的挥发性小于乙醇。

若溶液中DNA含量较高，基因组DNA大片段在乙醇或异丙醇作用下，沉淀形成纤维状絮团漂浮。

若溶液中DNA含量较低，会观察到管中含有白色悬浮的丝状或颗粒状DNA（甚至看不到沉淀），可使用预冷的异丙醇，或加入异丙醇后于－20℃冰箱放置20 min离心。

异丙醇（乙醇）沉淀DNA可以有效地去除残留的苯酚、氯仿和一些离子。

混匀过程要轻柔舒缓，以免DNA发生机械断裂。

6．倒掉上清液，加入300 μL TE 缓冲液，DNA能很快溶解。

可将上一步的DNA絮团捞出，在干净吸水纸上吸干后转入含300 μL TE的离心管。

DNA沉淀可溶于水或100 mmol/L TE（pH 8.0）溶液，是因为 DNA双螺旋外侧是亲水的磷酸基团和戊糖残基。

65℃水浴15 min可以帮助DNA沉淀溶解。

7．先后加入1/10体积的3 mol/L NaAc和2倍体积的预冷无水乙醇，温和颠倒混匀，放置20 min，使DNA形成絮状沉淀。

因上一步获得的DNA水溶液中不存在高浓度的氯化钠等盐离子，所以该步骤加入1/10体积的3 mol/L NaAc溶液，以中和DNA所带负电荷，使得DNA易于沉淀。

混匀过程要轻柔舒缓，以免DNA发生机械断裂。整个实验操作得当，通常可以得到长度50～100 kb的DNA。

将乙醇预冷可以加快沉淀进程。乙醇沉淀DNA有助于提高DNA浓度、去除盐离子。

8．室温下6 000 r/min离心5 min。

也可将上一步的絮状物用枪头（玻璃棒、牙签）挑至新离心管（事先将新管中放入500 μL 70%乙醇，便于释放絮团）后再离心。

离心速度过高和时间过长，导致沉淀块致密，会加大后续沉淀块溶解的难度。

    9．用70%乙醇漂洗沉淀表面和管壁两次，将离心管倒置在吸水纸上空气干燥。

漂洗过程中，倒出70%乙醇时避免让DNA沉淀随之流走。

漂洗时若沉淀悬浮起来，需要离心再倒掉70%乙醇。

倒置离心管时，不要让沉淀块滑到吸水纸上。

尽量让沉淀表面的乙醇挥发干净，否则影响DNA溶解和后续实验。

过分干燥的沉淀块比较难溶于水或TE缓冲液。

10．加100～200 μL 100 mmol/L pH8.0 TER（含RNase A 10 mg/mL）溶解，－20 ℃保存。

绝大部分的RNA可通过RNase A除去。如在第2步的CTAB提取缓冲液中加入了RNase A，就可以只用100 mmol/L pH8.0 TE溶解。

建议使用pH 8.0 TE溶解和保存DNA。DNA在弱碱性溶液最稳定。

也可溶于200 μL灭菌的ddH₂O，但ddH₂O因溶解了空气中的二氧化碳，而呈弱酸性（pH 6.8左右），不利于中长期保存。

（二）测定DNA浓度和纯度

1．取DNA溶液5 μL，稀释200倍。

取DNA溶液时，要混匀DNA溶液，可以用枪头轻轻搅拌均匀。

2．用紫外分光光度计在230nm、260 nm、280nm和310nm波长下测量吸光值。其中，OD₂₆₀用于估算样品中DNA的浓度，1个OD₂₆₀相当于50μg/mL双链DNA。

样品浓度（mg/mL）＝OD₂₆₀×稀释倍数×50/1000

而OD₂₆₀/OD₂₈₀与OD₂₆₀/OD₂₃₀用于估计DNA纯度。对于较纯的DNA样品，OD₂₆₀/OD₂₈₀≈1.8，OD₂₆₀/OD₂₃₀＞2。若OD₂₆₀/OD₂₈₀＞1.8，说明有RNA污染；若OD₂₆₀/OD₂₈₀＜1.8，说明有蛋白质污染。

核酸所含嘌呤和嘧啶分子具有共轭双键，在260 nm波长处有最大吸收峰。蛋白在280 nm波长处有最大吸收峰。OD₂₃₀来评估样品中是否存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等。OD₃₁₀为背景吸收值。

（三）琼脂糖水平电泳检测

1．取250 mL锥形瓶，用电子天平称取琼脂糖0.5 g。

2．加入1 × TAE电泳缓冲液50 mL （即1 %琼脂糖），摇匀。

3．用微波炉熔化，混匀。

忌猛火过长时间加热，避免暴沸和溢出。

加热过程中可暂停，戴厚线手套小心摇匀。熔化好的琼脂糖溶液澄清透明。

4．准备胶板，插上梳子。待溶液冷却至60℃左右时，向锥形瓶中加入2 μL EB（或其他荧光染料），摇匀，酌情将胶倒入制胶架。冷却凝固30 min后，拔出梳子。

5．置胶板于微型电泳槽后，倒入1 × TAE电泳缓冲液。

电泳缓冲液刚好没过凝胶表面1 mm为宜。

6．取2～5 μL DNA溶液与1～2 μL 6×上样缓冲液混合均匀，点样，电泳（55 V / 40 min）。

取DNA溶液时，要混匀DNA溶液，可以用枪头轻轻地搅拌均匀。

新手点样时，为防止手抖动，可将点样的手肘支于桌面，或用另一只手握住点样手腕。

点样时，枪头尖插到点样孔中下部，使点样液缓慢排出。枪头拔出液面时才松开拇指。

琼脂糖凝胶的点样孔一侧靠近黑色的负极。

7．紫外成像并分析。

七、实验报告

1. 预习作业

从植物细胞结构上看，想要提取植物基因组DNA应该采取哪些步骤？

2．结果分析与讨论

（1）附上琼脂糖凝胶电泳检测图（应标注DNA marker的名称及其片段大小、各泳道的材料名称），DNA条带是单一的吗？其位置在哪里？如果有弥散拖尾现象说明了什么？

（2）根据电泳图谱和OD数据，判断所提取的DNA是否满足后续实验要求。

八、思考题

1．为避免电泳检测时出现多条带和弥散现象，DNA提取过程应注意哪些事项？

2．CTAB提取缓冲液的主要成分有哪些？它们的作用分别是什么？

3．为什么上清液中加入2倍体积乙醇能够沉淀DNA？DNA沉淀为什么能够溶于水？

4．琼脂糖凝胶电泳检测DNA时，DNA为什么从负极向正极泳动？

九、研究案例

1．适用于大规模转基因作物PCR检测的简易DNA提取（钟罗宝和陈谷，2008）

该研究以转基因拟南芥叶片为样本，将改进碱裂解法作为一种简易有效的DNA提取法，以应用于大规模转基因作物PCR检测中。将碱裂解法、SDS法和CTAB法提取的基因组DNA电泳比较，结果表明，碱裂解法DNA含量很少，图谱中没有条带，SDS法DNA的质和量比碱裂解法大幅提高，但是CTAB法DNA质和量是最好的。但三种方法提取的DNA就能满足PCR扩增的要求。

2．对小麦幼叶DNA微量快速提取方法的改进（董建力等，2007）

该研究为满足对大批量材料进行分子标记检测的需要，以小麦幼叶为材料，对常规的CTAB法提取DNA方法进行了简化和修改。结果表明，从DNA样品的0.8%琼脂糖凝胶电泳图谱看出，常规提取法（液氮研磨、NaCl）、改进提取法Ⅰ（液氮研磨、用KCl代替NaCl）和改进提取法Ⅱ（不用液氮研磨、用KCl代替NaCl）都能得到条带清晰、亮度相近的DNA片断，说明这三种方法提取的DNA质量都较好；改进法的DNA（第4泳道和第6泳道）降解程度大于常规法，但也能满足后续分子标记的需求。由于该研究的DNA样品未用RNase处理，因此底部有少量的RNA和杂质存在。

十、附录

1．CTAB提取缓冲液：含有100 mmol/L Tris–HCl （pH 8.0）、50 mmol/L EDTA （pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、2% CTAB、0.1% β–巯基乙醇。

配制方法：将20 g CTAB和29.22 g NaCl溶于750 mL ddH₂O，再依次加入1 mol/L Tris–HCl（pH 8.0）100 mL，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）100 mL，10 mL β–巯基乙醇，混匀，定容至1 L。高压湿热灭菌20 min，4℃保存备用。

2．1 × TE缓冲液：含有10 mmol/L Tris–HCl （pH 8.0）、1 mmol/L EDTA （pH 8.0）。

配制方法：取1 mol/L Tris–HCl（pH 8.0）1 mL，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）0.2 mL，再加ddH₂O至100 mL，混匀。高压湿热灭菌20 min，4℃保存备用。

3．氯仿/异戊醇抽提液：氯仿和异戊醇按照24∶1的比例混合。

4．50 × TAE电泳缓冲液

5．6 ×上样缓冲液（室温贮存）

6．1 mol/L Tris–HCl（pH 8.0）

配制方法：将121.1g Tris溶于800 mL ddH₂O，用4 mol/L浓盐酸调节pH至8.0，定容至1 L。高压湿热灭菌20 min，4℃保存备用。

市售“发烟”盐酸（浓度为37%，密度1.179g/mL）为12 mol/L。高浓度盐酸易挥发，挥发出来的HCl气体在空气中与水蒸气结合形成雾。为使用方便，可稀释3～6倍。7．0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）

配制方法：在800mL ddH₂O中加入186.1g二水乙二胺四乙酸钠（EDTA–Na₂·2H₂O），充分搅拌，这时溶液为乳白色，加10 mol/L NaOH调解pH至8.0，这时溶液颜色逐渐变为澄清。最后定容至1L。高压灭菌，室温保存。

十一、拓展知识

1．关于凝胶电泳中溴化乙啶（EB）在荧光灯下的成像原理

溴化乙啶是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙啶用标准302 nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用带CCD 成像头的凝胶成像处理系统拍摄。

观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙啶进行染色，溴化乙啶含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙啶分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254 nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302 nm和366 nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590 nm处重新发射出来。由于溴化乙啶–DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20～30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙啶（0.5 μg/mL）时，可以检测到少至10 ng的DNA条带。

溴化乙啶可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链DNA或RNA染色的荧光是通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。

2．SYBR Green I在凝胶电泳中的应用

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，最大吸收波长约为497 nm，发射波长最大约为520 nm。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光信号会增强800～1 000倍。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，从而可根据荧光信号强度检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

SYBR Green I灵敏度高，至少可检出20 pg DNA，高于EB染色法25～100倍。用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低，适用于琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳和毛细管电泳等多种凝胶电泳。SYBR Green I对分子生物学中常用的酶（如：Taq 酶、逆转录酶、内切酶、T4连接酶等）没有抑制作用。另外，与EB相比，其诱变能力大大降低。

（1）工作液的配制：用电泳缓冲液将10 000×的SYBR GreenⅠ稀释100倍，即为SYBR GreenⅠ工作液。SYBR GreenⅠ工作液可以置2～8℃冷藏1个月以上。

（2）制胶：按常规方法制胶，不含任何染料和EB。

（3）样品染色：向分析样品中加入SYBR GreenⅠ工作液和载样缓冲液，室温放置10 min，使SYBR GreenⅠ与样品中DNA充分结合。SYBR GreenⅠ工作液加入量为总上样量的1/10。

（4）DNA marker染色：将5 μL DNA marker和1 μLSYBR GreenⅠ工作液混匀，室温放置5 min，使SYBR GreenⅠ与DNA充分结合。

3．DNA提取常见问题分析

（1）DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

相关产品推荐：